DOI: https://doi.org/10.21897/rta.v15i1.812

AISLAMIENTO ENZIMÁTICO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE MESÓFILO DE Dioscorea alata CULTIVAR “Pico de Botella”

Jorge A. Osorio, Elvis E. Bustamante, Mayerlis M. Macareno, Eduardo J. Hernandez, Javier D. Beltrán

Resumen


Un protoplasto vegetal es una célula que carece de pared celular, se encuentra rodeada por su membrana plasmática y es potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. El objetivo del trabajo fue evaluar diferentes concentraciones de enzimas comerciales y tiempos de acción en el aislamiento de protoplastos de Dioscorea alata cultivar “Pico de Botella”. Los protoplastos fueron aislados del mesófilo de vitroplantas combinando concentraciones de las enzimas Celulasa Onozuka R10® (0,0 a 1,5% p/v) y Macerozima R10® (0,0 a 0,5% p/v), a tiempos de acción de 6 a 18h y pH de 5,6; exponiendo aproximadamente 0,015g de hoja en medio de aislamiento de protoplastos de ñame a 27±2 °C, 40 rpm, seguido de lavado en medio de aislamiento sin enzimas, purificación en sacarosa al 24%, resuspensión en medio de cultivo de protoplastos de ñame y conteo en cámara de Neubauer. La mayor cantidad de protoplastos se obtuvo con Celulasa al 1% y Macerozima al 0,5% en 18h de acción, con un promedio de 18,6 x106 protoplastos g-1 de tejido fresco. Los análisis de regresión (R2 = 0,84) de los datos obtenidos arrojaron, que las condiciones óptimas para obtener la mayor cantidad de protoplastos aislados corresponden a una combinación de 0,96% de Celulasa y 0,36% de Macerozima, a 13,99 h de acción, estimando un valor de 15,3x106 protoplastos g-1 de tejido. El método enzimático permite aislar protoplastos de ñame, recomendándose evaluar su viabilidad para regeneración su pared celular, crecer, dividirse y formar microcolonias y microcallos. Palabras clave: ñame, celulasa, macerozima, protoplasto.

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Referencias


Agudelo, L.; Pedrosa, M.R., Carranza, J., Cardozo, P. F., Torres, M. y Acevedo, F. 1995. Estudio base para la identificación de líneas de acción del trabajo en Biotecnología con pequeños y medianos productores agropecuarios en la Costa Atlántica. Programa de Biotecnología, Gobierno de Holanda. CORPOICA. Programa Nacional de Estudios Socioeconómicos. Centro de Investigación Turipaná, Regional 2 de Corpoica, p51.

Albersheim, P. and Darvill, A. 1985. Oligosaccharins. En: Ishii, S. 1988. Factors Influencing Protoplast Viability of Suspensión-Cultured Rice Cells during Isolation Process. Plant Physiology 88: 26-29.

Álvarez, A. 2000. Prácticas agronómicas para el cultivo de ñame. En: Guzmán, M. y Buitrago, G. Ñame: Producción de semillas por biotecnología. Editorial Unibiblos, Bogotá, p33–39.

Alves, C., Quecini, V. and Viera, M. 1999. Plant transformation: Advances and Perspectives. Scientia Agricola 56 (1): 1-8.

Assani, A., Haicour, R., Wenzel, G., Côte, F., Bakry, F., Foroughi-Wehr, B., Ducreux, G., Aguillar, M.-E. and Grapin, A. 2001. Plant regeneration from protoplasts of dessert banana cv. Grande Naine (Musa spp., Cavendish sub-group AAA) via somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 20: 482-488.

Azpíroz, S. 1994. La biotecnia y el sector agropecuario. Agronomía mesoamericana 5: 140-158.

Babaogiu, M. 2000. Protoplast Isolation in lupin (Lupinus mutabillis sweet): Determination of optimun Explant sources and Isolation conditions. Turkish Journal of Botany 24: 177- 185.

Cogne, A. 2002. Phytochemical investigation of plants used in African traditional medicine: Dioscorea sylvatica (Dioscoreaceae), Urginea altissima (Liliaceae), Jamesbrittenia fodina and Jamesbrittenia elegantissima (Scrophulariaceae). Thèse de doctorat Pharmacognosie et Phytochimie, Universidad de Lausanne (Suiza), Lausanne.

Cohen A., Lipsky A., Arazi T., Ion A., Stav R., Sandler-Ziv D., Pintea C., Barg R., Salts Y., Shabtai S., Gaba V., Gera A., 2004. Efficient genetic transformation of Lilium longifolium and Ornithogalum dubium by particle acceleration followed by prolonged selection in liquid medium. Acta Horticulturae 651: 131-138.

Díaz, M.; Zappacosta, D.; Franzone, P.; Ríos, R. 2004. Transformación genética. En: Echenique, V., Rubinstein, C. y Mroginski, L. (Ed). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ediciones INTA, Buenos Aires, p109-123.

Divakaran, M., Pillai, G., Nirmal, K. and Peter, K. 2008. Isolation and fusion of protoplasts in Vanilla species. Current Science, 94 (1): 115-120.

Geerts, P., Druart, P., Ochatt, S. and Baudoin, J. 2008. Protoplast fusion technology for somatic hybridisation in Phaseolus. Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement 12 (1): 41-46.

Guangyu, CH., Conner, A., Christey, M., Fautrier, A. and Field, R. 1997. Protoplast isolation from shoots of asparagus cultures. International Journal of Plant Sciences 158 (5): 537-542.

Gutiérrez, A., Santacruz, F., Cabrera, J., y Rodríguez, B. 2003. Mejoramiento genético vegetal in vitro. e-Gnosis 1: 1-19.

ICA, 2009. Exportadores de ñame de la mano del ICA. www.ica.gov.co/Noticias/ Agrícola/2009/Exportadores-namede-la-mano-del-ICA.aspx

Kanchanapoom, K., Jantaro, S. and Rakchad, D. 2001. Isolation and Fusion of Protoplasts from Mesophyll Cells of Dendrobium Pompadour. Science Asia 27: 29-34.

Levitus, G., Rivero, M., Segretin, M., Morgenfeld, M., Zelada, A., Martinez, C., Gudesblat, G., Modena, N. y Mencacci, N. 2005. Agrobiotecnología: Guía de trabajos prácticos. Departamento de Fisiológia, Osorio - Aislamiento Enzimático de Protoplastos Biología Celular y Molecular. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires, p76.

Lin, W. 1983. Isolation of Mesophyll Protoplasts from Mature Leaves of Soybeans. Plant Physiology 73: 1067-1069

Mantell, S. 1994. Summary of the Final report of EU Contract TS2-A-117: Development of anthracnose disease resistant Dioscorea yams using somatic fusion techniques. En: Tor, M., Twyfor, T., Funes, I., Baccon, J., Ainswofth, C. and Mantell, S. 1998. Isolation and Culture of Protoplasts from Immature leaves and embryogenic Cell Suspensions of Dioscorea yams: tools for transient gene expression studies. Plant cell Tissue and Organ Culture 53:113-125.

Minagricultura: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. 2004. Anuario estadístico del sector agropecuario. Dirección de Política Sectorial – Grupo Sistemas de Información. Editorial Bochica Ltda, Bogotá, p272.

Narayanaswamy, P. 1994. Development of In vitro plant regeneration and RAPD genetic fingerprinting of food yams (Dioscorea alata L). Ph.D. thesis, Wye College, University of London (UK), London.

Prasertsongskun, S. 2004. Isolation and culture of suspension protoplasts of vetiver. Journal of Science and Technology 26 (3): 411-416

Perea, M. 2000. Utilización de los sistemas In vitro para la obtención de plantas de ñame (Dioscorea spp) libre de patógenos. En: Guzmán, M y Buitrago, G. Ñame: Producción de semillas por biotecnología, Unibiblos, Bogotá, p41– 53.

Pérez, A. 2010. Ñameros se preparan con el ICA para exportar en grande. Cartagena de Indias. El Universal. URL: http://www.eluniversal.com.co/ v2/sincelejo/economica/nameros-sepreparan-con-el-ica-para-exportaren-grande [07 Abril 2010]

Pérez, J., Albert, D., Rosete, S., Sotolongo, L., Fernádez, M., Delprete, P. y Raz, L. 2005. Consideraciones etnobotánicas sobre el género Dioscorea (Dioscoreaceae) en Cuba. Ecosistemas 14 (2): 142-149.

Pindel, A. 2007. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae 19 (2): 79-88

Polci, P. y Friedrich, P. 2004. Hibridación Somática. En: Echenique, V., Rubinstein, C. y Mroginski, L. (Ed). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ediciones INTA, Buenos Aires, p97-108.

Rodriguez, C. y Beltrán, J. 2002. Cultivo In vitro de ñame (Dioscorea alata) c.v “Pico de Botella” a partir de segmentos nodales. Tesis de Biología con énfasis en Biotecnología, Universidad de Sucre. Sincelejo.

Saker, S., Neuman, K. H., Badawy, E. M., ELBahr, M. K. and Taha, H. S. 1999. Isolation and Culturing of Protoplasts from Hypericum perforatum L. Arab Journal of Biotechnology 2(2): 227- 234.

Sauer, A. and Walther, F. 1987. Protoplast Culture of Dioscorea opposita Thumb (Dioscorea batatas Decne). En: Tor, M., Twyfor, T., Funes, I., Baccon, J., Ainswofth, C. and Mantell, S. 1998. Isolation and Culture of Protoplasts from Immature leaves and Embryogenic Cell Suspensions of Dioscorea yams: tools for transient gene expression studies. Plant cell, Tissue and Organ Culture 53:113- 125.

Shepard, J. and Totten, R. 1977. Mesophyll cell protoplast of potato; Isolation, proliferation and plant regeneration. Plant physiol 60: 313-316.

Shillito, R., Caeswell, G., Johnson, C., Dimalo, J. and Harms, C. 1989. Regeneration of Fertile Plants from Protoplast of elite inbred Maize. Research papers, Bio/Technology 7: 581–587.

Sutiojono, E., Nonhebel, H. and Kantharajah, A. 1998. Factor Affecting Protoplast Culture of Cucumis melo “Green Delica”. Annals of Botany 81: 775- 777.

Tor, M., Twyfor, T., Funes, I., Baccon, J., Ainswofth, C. and Mantell, S. 1998. Isolation and Culture of Protoplasts from Immature leaves and embryogenic Cell Suspensions of Dioscorea yams: tools for transient gene expression studies. Plant cell, Tissue and Organ Culture 53: 113- 125.

Twyford, C. and Mantell, S., 1996. Production of somatic embryos and plantlets from root cells of the greater yam. Plant cell, Tissue and organ culture 46 (1): 17-26.

Uchimiya, H. and Murashige, T. 1974. Evaluation of Parameters in the Isolation of Viable Protoplasts from Cultured Tobacco Cells. Plant Physiology 54: p936-944.


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