Validación de PCR para detección de Listeria monocytogenes en carnes de res y pollo

Contenido principal del artículo

Autores

Kirvis Torres Raul Poutou Ana Carrascal Sara Sierra Marcela Mercado

Resumen

Listeria monocytogenes es un microorganismo zoonótico emergente en la industria de alimentos, resultando de gran interés para la salud pública. El objetivo de este trabajo fue validar la técnica de PCR para la detección de este microorganismo en carnes crudas de res y pollo. El procedimiento de extracción de ADN fue realizado con lisozima, proteinasa K y fenol-cloroformo a partir de muestras contaminadas artificialmente. La especificidad de los cebadores LI1 y U1 fue comprobada por la amplificación de una banda de 938pb correspondiente a un fragmento del ADNr 16S; de igual manera los cebadores LF y LR amplificaron una banda del gen hly A de 750pb; lo que permitió la identificación de género (banda 938pb) y especie (banda de 750pb) respectivamente. Las cepas de los otros géneros bacterianos ensayados no amplificaron ninguna de las bandas específicas. El límite de detección para la PCR fue de 10 2 y 104 UFC/gr para carnes de res y pollo respectivamente; el «Gold Standard» reportó 10 2 UFC/ml para ambos alimentos. La comparación de la PCR vs., el método «Gold Standard» reportó en carne de pollo una concordancia observada de 98.43%, una sensibilidad del 96.9%, una especificidad de 100%, un valor predictivo positivo del 100% y un valor predictivo negativo del 97%; para la carne de res todos los parámetros anteriores fueron del 100%. Estos resultados demostraron la factibilidad de la PCR para el control de calidad de carnes crudas de res y pollo.

Palabras clave:

Detalles del artículo

Referencias

1.Agersborg A, Dahl R, Martinez I. Sample Preparation and DNA Extraction Procedures for Polymerase Chain Reaction Identification of Listeria Monocytogenes in Seafoods. International Journal of Food Microbiology 1997; 35:275 - 280. http://dx.doi.org/10.1016/S0168-1605(97)01245-2

2. Allaert C, Escolá M. Métodos de Análisis Microbiológicos de Alimentos, Díaz de Santos S.A. 2002

3. Allmann M, Hofelein C, Koppel E, Luthy J, Meyer R, Niederhauser C, Wegmuller B, Candrian U. Polymerase Chain Reaction (PCR) for Detection of Pathogenic Microorganisms in Bacteriological Monitoring of Dairy Products. Research Microbiology 1995; 146:85 - 97. http://dx.doi.org/10.1016/0923-2508(96)80273-7

4. Bansal N S. Development of a Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of L. monocytogenes in Foods. Applied Microbiology 1996; 22:353 - 356. http://dx.doi.org/10.1111/j.1472-765X.1996.tb01177.x

5. Beumer R R, Hazeleger V C. Listeria monocytogenes: Diagnostic Problems. FEMS Inmunology and Medical Microbiology 2003; 35: 191 - 197. http://dx.doi.org/10.1016/S0928-8244(02)00444-3

6. Boerlin P, Bannerman E, Bille J, Jemmi T. Typing L. monocytogenes Isolates from Fish Products and Human Listeriosis Cases. Applied and Environmental Microbiology 1997; 63(4):1338 - 1343.

7. Bohnert M, Dilasser F, Dalet C, Mengaud J, Cossart P. Use of Specific Oligonucleotides for Direct Enumeration of Listeria monocytogenes in Food Samples by Colony Hibridization and Rapid Detection by PCR. Result Microbiology 1992; 143: 271-280. http://dx.doi.org/10.1016/0923-2508(92)90019-K

8. Burbano E, Carrascal A, Mercado M, Poutou R. Validación de PCR para

9. Burtscher C, Fall P, Wilderer P, Wuertz S. Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in Suspected Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR. Applied and Environmental Microbiology 1999; 65:2235 - 2237.

10. Curiale M, Lewus C. Detection of Listeria monocytogenes in Samples Containing Listeria innocua. Journal of Food Protection 1994; 57: 1048 - 1051.

11. Da Silva M C, Tibana A. Listeria monocytogenes em Alimentos: Seu Significado Nos Dias Atuais. Higiene Alimentar 1995; 9: 7-10.

12. Dickinson J, Kroll R, Grant K. The Direct Application of the Polymerase Chain Reaction to DNA Extracted From Foods. Letters in Applied Microbiology 1995; 20:212 - 216. http://dx.doi.org/10.1111/j.1472-765X.1995.tb00430.x

13. Duffy G, Cloak O, Sheridan J, Blair I, McDowell D. The Development of a Combined Surface Adhesion and Polymerase Chain Reaction Technique in the Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Meat and Poultry. International Journal of Food Microbiology 1999; 49:151 - 159. http://dx.doi.org/10.1016/S0168-1605(99)00091-4

14. Farber J, Daley E. Presence and Grown of Listeria monocytogenes in Naturally Contaminated Meats. International Journal of Food Microbiology 1994; 22:33 - 42 http://dx.doi.org/10.1016/0168-1605(94)90005-1

15. Fitter S, Heuzenroeder M, Thomas C J. A Combined PCR and Selective Enrichment Method for Rapid Detection of Listeria monocytogenes. Journal of Applied Bacteriology 1992; 73:53 - 59. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.1992.tb04968.x

16. Furrer B, Candrian U, Hofelein Ch, Luthy J. Detection and Identification of Listeria monocytogenes in Cooked Sausage Products and in Milk by in Vitro Amplification of Haemolysin Gene Fragments. Journal of Applied Bacteriology 1991; 70:372 - 379. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.1991.tb02951.x

17. Golsteyn T E J, King R K, Burchak J, Gannon V P J. Sensitive and Specific Detection of Listeria monocytogenes in Milk and Ground Beef with Polymerase Chain Reaction. Applied and Environmental Microbiology 1991; 57(9):2576-2580.

18. Goulet V, Lepoutre A, Rocourt J, Courtieu A L, Dehaumont P, Veit P. Lépidémie de Listériose en France. Bilan Final et Résultats de L'enquète Épidémiologique. Bulletin Epidémiologie Hebdomadaire 1993; 4:13 - 14.

19. Hokanson G C. A Life Cycle Approach to the Validation of Analytical Methods During Pharmaceutical Product Development, Part Y: The Initial Method Validation Process. Pharmaceutical Technology: 1994; 118 - 130.

20. ICONTEC. Industrias Alimentarias. Pollo Beneficiado. Norma Técnica Colombiana 3644- 2. Bogotá, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: 1998; 1-78.

21. ICONTEC. Microbiología de Alimentos y Alimentos para Animales. Método Horizontal para la Detección de Listeria monocytogenes. Norma Técnica Colombiana 4666. Bogotá, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: 1999; 1-25.

22. Ingianni A, Floris M, Palomba P, Madeddu M A, Quartuccio M, Pompei R. Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Foods, by a Combination of PCR and DNA Probe. Molecular and Cellular Probes 2001; 15:275 - 280. http://dx.doi.org/10.1006/mcpr.2001.0372

23. Jung Y S, Frank J F, Brackett R E, Chen J. Polymerase Chain Reaction Detection of Listeria monocytogenes on Frankfurters Using Oligonucleotide Primers Targeting the Genes Encoding Internalin AB. Journal of Food Protection 2003; 66(2):237 - 241. 25. Makino S, Okada Y, Maruyama T. A New Method for Direct Detection of L.monocytogenes From Food by PCR. Applied and Environmental Microbiology 1995; 61(10):3745 - 3747.

24. Kaclíková E, Pangallo D, Drahovská H, Oravcová K, Kuchta T. Detection of Listeria monocytogenes in Food, Equivalent to ISO 11290-1 or ISO 10560, by a Three Days Polymerase Chain Reaction Based Method. Food Control 2003; 14: 175 - 179. http://dx.doi.org/10.1016/S0956-7135(02)00085-3

25. Salvat G, Toquin M T, Michel Y, Colin P. Control of Listeria monocytogenes in the Delicatessen Industries: The Lessons of a Listeriosis Outbreak in France. International Journal of Food Microbiology 1995; 25:75 - 81. http://dx.doi.org/10.1016/0168-1605(94)00087-M

26. Manzano M, Cocolin L, Ferroni P, Cantoni C, Comi G. A Simple and Fast PCR Protocol to Detect Listeria monocytogenes from Meat. Journal of the Science of Food and Agriculture 1997; 74:25 - 30. http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1097-0010(199705)74:1<25::AID-JSFA759>3.3.CO;2-M http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1097-0010(199705)74:1<25::AID-JSFA759>3.0.CO;2-V

27. Miller D, Bryant J, Madsen E, Ghiorse W. Evaluation and Optimization of DNA Extraction and Purification Procedures for Soil and Sediment Samples. Applied and Environmental Microbiology 1999; 65(11):4715 - 4724.

28. Niederhauser C, Candrian U, Hofelein C, Jermini M, Buhler H P, Luthy J. Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Listeria monocytogenes in Food. Applied and Environmental Microbiology 1992; 58(5):1564 - 1568.

29. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Informe de la Consulta Mixta FAO/OMS de Expertos sobre la Evaluación de Riesgos Asociados a los Peligros Microbiológicos en los Alimentos. Roma, Consulta de Expertos AD HOC sobre la Evaluación de Riesgos Asociados a los Peligros Microbiológicos en los Alimentos: 2000; 27-30.

30. Ortega C, Noordhuizen J P T M, Starks M, Thrusfield M. Manual Interactivo de Epidemiología, Red Europea de Epidemiología Veterinaria y Economía; 1995.

31. Paziak-Domanska B, Boguslawska E, Wieckowska- Szakiel M, Kotlowski R, Rózalska B, Chmiela M, Kur J, Dabrowski W, Rudnicka W. Evaluation of the API Test, Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C activity and PCR Method in Identification of Listeria monocytogenes in Meat Foods. FEMS Microbiology Letter 1999; 171:209 - 214. http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6968.1999.tb13434.x

32. Pérez A, Rodríguez N, Gil J F, Ramírez G A. Tama-o de la Muestra. Versión 1.1. Programa Sistematizado para el Cálculo del Tama-o de la Muestra y el Poder en Dise-os de Investigación, Facultad de Medicina. Unidad de Epidemiología Clínica y Bioestadística. Pontificia Universidad Javeriana; 2001.

33. Poutou R, Máttar S. Amplificación al Azar del Polimorfismo del ADN (RAPD) de Cepas de E.coli O157:H7 Aisladas de Pacientes Pediátricos. Pediatría 2000; 35(3):259 - 263.

34. Poutou R, Máttar S, Del Portillo P, Visbal J, Bermúdez A. RAPD Fingerprinting of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Isolates in Santafé de Bogotá, DC, Colombia. Medical Science Research 2000; 28:29 - 32.

35. Qvist S, Sehested K, Zeuthen P (1994). Growth Suppression of Listeria monocytogenes in a Meat Product. International Journal of Food Microbiology 24: 283-293. http://dx.doi.org/10.1016/0168-1605(94)90126-0

36. Ramírez L J, Urquijo G A. Inspección, Vigilancia y Control de las Carnes de Bovinos y Porcinos en Bogotá, D.C. Boletín Epidemiológico Distrital 2002; 7(5): 2-11.

37. Rossen L, Norskov P, Holmstrom K, Rasmussen O F. Inhibition of PCR by Components of Food Samples, Microbial Diagnostic Assays and DNA- extraction Solutions. International Journal of Food Microbiology 1992; 17:37 - 45. http://dx.doi.org/10.1016/0168-1605(92)90017-W

39. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Gel Electrophoresis of DNA. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989; 1: 1-62.

40. Sambrook J, Manniatis T, Fritsch E F. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1983.

41. Scotter S L, Langton S, Lombard B, Schulten S, Nagelkerke N, In't Veld P H, Rollier P, Lahellec C. Validation of ISO Method 11290 Part 1. Detection of Listeria monocytogenes in Foods. International Journal of Food Microbiology 2001; 64:295 - 306. http://dx.doi.org/10.1016/S0168-1605(00)00462-1

42. Simon M, Gray D, Cook N. DNA Extraction and PCR Methods for the Detection of L.monocytogenes in Cold - Smoked Salmon. Applied and Environmental Microbiology 1996; 62(3):822 - 824.

43. Somer L, Kashi Y. A PCR Method Based on 16S rRNA Sequence for Simultaneous Detection of the Genus Listeria and the Species Listeria monocytogenes in Food Products. Journal of Food Protection 2003; 66(9):1658 - 1665.

44. Sox H C. Common Diagnostic Tests Use and Interpretation. Philadelphia, American College of Physicians1987.

45. Torres K J, Sierra S C, Poutou R A, Vera H, Carrascal A K, Mercado M. Incidencia Y Diagnóstico De Listeria Monocytogenes; Microorganismo Zoonótico Emergente En La Industria De Alimentos. UDCA Actualidad & Divulgación Científica 2004; 7(1):25 - 57.

46. Uyttendaele M, Schukkink B, Gemen B, Debevere J. Influence of Bacterial Age and pH of Lysis Buffer on Type of Nucleic Acid Isolated. Journal of Microbiological Methods 1996; 26: 133 - 138. http://dx.doi.org/10.1016/0167-7012(96)00904-9

47. Vera H. Comunicación Personal. Referente de Ambiente, Secretaría Distrital de Salud, Bogotá, Colombia. Santa Fé de Bogotá 2003.

48. Vorster S M, Greebe R P, Nortjé G L. The Incidence of Listeria in Processed Meats in South Africa. Journal of Food Protection 1993; 58: 169 - 175.

49. Wan J, King K, Forsyth S, Coventry M J. Detection of Listeria monocytogenes in Salmon Using the Probelia Polymerase Chain Reaction System. Journal of Food Protection 2003; 66(3): 436 - 440.

50. Weon S C, Chong-Hae H. Rapid Enumeration of Listeria monocytogenes in Milk Using Competitive PCR. International Journal of Food Microbiology 2003 In press. 51. Zamora A, Ossa H, Carrascal A, Poutou R, Jimenez D. Identificación Preliminar de L. monocytogenes por PCR. Laboratorio Actual 2000; 17(33):38 - 41.

Descargas

La descarga de datos todavía no está disponible.