INTRODUCCIÓN

La creciente actividad industrial es culpable en gran parte de los principales problemas de contaminación ambiental y del daño en los ecosistemas, generando la acumulación de contaminantes tóxicos como los metales pesados cromo, cobre, plomo, cadmio, cinc, níquel, mercurio, etc. (Pino et al. 2006) y causando daños en la salud humana, por ejemplo, el plomo (Pb) es uno de los metales pesados más tóxicos, causando anemia, encefalopatía, hepatitis y síndrome nefrítico (Deng et al. 2006). La exposición a cadmio (Cd) genera riesgos severos a la salud humana, puede provocar cáncer, daño renal, destrucción de la membrana mucosa, vómito, diarrea, daño óseo, y la enfermedad de itai-itai, así como también afecta la producción de progesterona y testosterona (Johannes et al. 2006).

Existen varias tecnologías para remediar la carga de metales pesados de agua residual industrial, en donde solo la adsorción es viable a escala industrial en cuanto a la relación costo-beneficio (Lin et al. 2008). Sin embargo, el precio elevado de adsorbentes (usualmente carbón activado) es considerado como el principal obstáculo para la aplicación industrial. Por eso el foco de estudio de adsorción de metales pesados ha estado inclinado hacia materiales naturales que están disponibles en cantidades extensas (Agarwai et al. 2006). Se han publicado estudios en relación con el posible uso del hongo Penicillium sp., como un potencial bioadsorbente de metales pesados por su extraordinaria capacidad de adsorción extracelular (Fan et al. 2008).

Por lo antes indicado, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de remoción simultanea de los metales Pb (II) y Cd (II) en soluciones acuosas por medio de hongos Penicillium sp., aislando la cepa fúngica del suelo de una mina de alta carga de contaminantes como la mina el Alacrán (Córdoba-Colombia), determinando la influencia en la remoción de las variables pH, concentración inicial de metales y temperatura de medio. Verificando los grupos funcionales activos de la biomasa fúngica que intervienen en el fenómeno de adsorción por medio de análisis infrarrojo (IR), analizando los modelos de adsorción de isotermas Langmuir y Freundlich.

MATERIALES Y METODOS

Muestreo y caracterización de cepas fúngicas de Penicillium sp
Las muestras de suelo fueron colectadas en enero del 2013, en la mina el Alacrán (Córdoba- Colombia), localizada en las coordenadas planas Norte = 1'347.808 y Este = 817.222. Se tomaron diez muestras al azar a 330 metros de la entrada de la mina, excavando con una pala estéril aproximadamente 0,5 m tomando aproximadamente 500 g de suelo, se homogenizaron las muestras de cada punto en un recipiente plástico estéril, separando cerca de 500 g en fundas estériles herméticas para transportar al laboratorio (Valencia 2004).

Para realizar el aislamiento de la cepa fúngica, se tomó 1g de muestra de suelo, que fue disuelta en agua bidestilada esterilizada. Se utilizaron placas (pH 5) de Agar Czapek-Dox (CDA) con suplementos de sulfato estreptomicina (25 mg/100 mL) y ciclohexamida (6 mg/100 mL) para el aislamiento de hongos tolerantes de metales (Natarajan et al. 2010). De la muestra diluida de suelo, se tomó 0,1 mL inoculando en placas Agar CDA. Las placas inoculadas se incuban a 25°C durante siete días, tomando placas control con inoculaciones de agua bidestilada esterilizada, incubadas en las mismas condiciones.

Después del período de incubación, la especie de hongo crece en las placas y se transfieren a placas Agar CDA encubándose hasta que el crecimiento se haya completado. A partir de los cultivos de crecimiento en medios Agar CDA de siete días de crecimiento, las muestras fúngicas cultivadas se dividen y se observan características macroscópicas y microscópicas, de acuerdo a Valencia (2004). El cultivo fúngico puro se mantiene tanto en placas de Agar de Czapek- Dox como en caldos. El crecimiento masivo del hongo se realizó en medio líquido Czapek-Dox por treinta días. La biomasa generada de hongos Penicillium sp. se extrae por tamizado, siendo el material base de los experimento de biosorción (Natarajan et al. 2010).

Diseño experimental
Se utilizó un diseño experimental por bloques de un solo factor, donde la respuesta a medir fue la concentración de los iones metálicos en el equilibrio. Para cada factor en particular (Concentración inicial de metales, pH y temperatura) se mantuvieron, las demás variables fueron constantes, estrategia fuertemente recomendable si se supone que la variabilidad de los factores es alta. Los resultados de los análisis son presentados por la media (X̅) ± desviación estándar (DS) de las determinaciones por duplicado. Para todos los análisis estadísticos el criterio de significancia se estableció a p<0.05. El tratamiento de los resultados se realizó mediante el paquete estadístico Excel 2007 (Microsoft Office).

Experimentos de Biosorción
Se preparó una solución madre mixta de Pb (II), y Cd (II) a 1000 mg L-1, a partir de reactivos marca Merck. Todos los experimentos de biosorción se llevan a cabo con la misma solución madre (Natarajan et al. 2010). El efecto de la concentración de metales se determinó usando 100 mL de un stock múltiple de Pb (II) y Cd (II) a 8,0; 30,0; 51,5 y 103,0 mg L-1 (preparado a partir de la solución madre) y 0,5 g de biosorbente a pH 4 y 30°C. Se incubaron en frascos agitando a 200 r/min durante 24 horas, después del período de incubación, los sobrenadantes se recogen por centrifugación a 6000 r/min durante 30 min. Luego la concentración de metales es determinada en el sobrenadante por absorción atómica con atomización electrotermia. El efecto de la concentración inicial arrojó los datos necesarios para el análisis de isotermas Freundlich y Langmüir. El efecto de pH se evalúa preparando un stock mixto de Pb (II) y Cd (II) a 51,5 mg/L y 0,5 g de biosorbente y el pH de las soluciones fue de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

El efecto de la temperatura se determinó usando stock múltiple de Pb (II) y Cd (II) a 51,5 mg L-1 y 0,5 g de biosorbente a pH 4. Las muestras se incubaron en frascos agitando a 200 r/min durante 24 horas a 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60°C, respectivamente. Cada uno de los ensayos se realizó por duplicado, Después del período de incubación, el sobrenadante se recogió y analizó como lo describe en el efecto concentración inicial (Natarajan et al. 2010). Los análisis de metales se realizaron usando un espectrómetro marca THERMO SCIENTIFIC modelo ICE 3000 Serie, con una longitud de onda de 217 y 228,8 nm para Pb y Cd, respectivamente.

Análisis experimental de datos
La cantidad adsorbida de Pb (II) y Cd (II) por la biomasa fue calculada usando la ecuación 1.

Donde qe es la cantidad adsorbida por la biomasa en (mg/g), C0 es la concentración inicial de los metales, Ce es la concentración de los iones Pb (II) y Cd (II) en el equilibrio, V es el volumen de la solución (L) y W es la cantidad de adsorbente (g), el experimento se realizó a 30°C (Yi y Shui 2011).

Los datos de adsorción para las concentraciones de adsorbato fueron descritos por los modelos de isotermas Langmuir y Freundlich. El modelo Langmuir se describe según la ecuación 2 y el modelo Freundlich por la ecuación 3.

Donde qe es la cantidad adsorbida por la biomasa en (mg/g), Ce es la concentración de los iones en el equilibrio, qmax representa la cantidad máxima adsorbida, b es la afinidad entre biosorbente y biosorbato, Kf y 1/n son las constantes de isoterma Freundlich (Yi y Shui 2011).

Valoración de los sitios de unión metalbiomasa
Se analiza preparando un stock mixto de Pb (II) y Cd (II) a 51,5 mgL-1 y 0,5 g de biosorbente, después de 24 horas, posteriormente la biomasa se secó a temperatura ambiente. Los espectros IR se realizaron utilizando un espectrofotómetro FT-IR Nicolet Is5 THERMO SCIENTIFIC en la región de 500-4000cm-1 (Natarajan et al. 2010).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización de cepas fúngicas de Penicillium sp
El hongo presentó colonias blancas, aterciopeladas, ya avanzado en tiempo de crecimiento presentó una coloración verdosa oscura, no generó pigmentos en los medios de crecimiento. Mostró formaciones concéntricas, conservando su anverso de color blanco. Sus hifas vegetativas, formadas por simple división, dieron origen a métulas. Cada métula dio origen a tres fiálides que terminaban en células conidiógenas o conidióforos, que a su vez, dieron origen a conidios. Se observa su peculiar forma de “cabeza de cepillo”. Sus conidios son de forma oval y que presentaron desprendimiento a manera de cadena, lo que confirma que positivamente se trata de la especie Penicillium sp. (Valencia 2004).

Efecto de la concentración inicial de metales, pH y temperatura en la remoción de metales por Penicillium sp
En el efecto de la concentración inicial de metales se muestra en la figura 1 que grafica él porcentaje de adsorción de Pb (II) y Cd (II) en los distintos niveles de concentración.

Para el Pb (II) los más altos niveles de remoción se hallan a las concentraciones 51,5 y 103 mg L-1 con porcentajes de 62,9 y 60,4% respectivamente. En el caso del Cd (II) las más altas remociones se encontraron en niveles de concentración de 30 y 51,5 mg L-1 con porcentajes respectivos de 12,4 y 14,6%.

A medida que aumentan las concentraciones de los metales en la solución la capacidad de adsorción se va manteniendo constante, debido a la saturación de los sitios disponibles en la superficie del biosorbente (Volesky y Holan 1995).

En general en el nivel de 51,5 mg L-1 corresponde a la concentración adecuada en que se pudo encontrar los mayores porcentajes de remoción de los dos contaminantes tóxicos. Los diferentes porcentajes de adsorción para los contaminantes muestran que el biosorbente adsorbe en una mayor cantidad los iones Pb (II) que Cd (II).

Para el efecto pH la máxima eliminación de Pb (II) se observó entre pH 6 y pH 10 de acuerdo con la figura 2, la biosorción de Pb (II) por Penicillium sp. aumentó gradualmente de pH 2 a pH 5 y se estabilizó en 6. Para el Cd (II) la adsorción aumenta con el pH del sistema, el aumento se aprecia entre los valores de 3 a 5,alcanzando su máxima eliminación a pH 6 y una posterior estabilización de 7 a 10.

Figura 1. Efecto de la concentración inicial de metales tóxicos en la Adsorción por Penicillium sp.

Así, las adsorciones más altas se lograron en un pH ácido (4-5), pudiéndose apreciar que se reduce en pHs alcalinos. A pH bajo, en la superficie del hongo las cargas positivas impiden el contacto de los iones metálicos y la superficie cargada negativamente (Gupta y Rastogi 2008). Sin embargo, el aumento del pH entre 4 y 5 aumenta la eliminación de los iones metálicos disponibles en la solución, porque la neutralización de las cargas positivas en la superficie de hongo, mejora el contacto entre los iones metálicos y la superficie. Por encima de pH 7 los iones metálicos precipitan en la solución y se inhibe el contacto entre la carga negativa de la superficie del hongo y los iones metálicos (Gupta y Rastogi 2008). Por lo tanto, la eliminación de iones metálicos se estabiliza por encima de pH 7. Similares resultados fueron publicados por Fan y colaboradores (2008) para la eliminación de Pb (II) mediante el uso de Penicillium simplicissimum. Yan y Viraragavan (2003) también informaron que la eliminación de Pb (II) por Penicillium digitatum y Rhizopus nigricans, disminuía con disminuir el pH y aumenta con el aumento del mismo.

Los resultados del efecto temperatura se resumen en la figura 3, donde la relación de adsorción de metales por unidad de biomasa aumento con la temperatura para todos los metales logrando valores máximos a 60°C.

Resultados similares se reportaron por Fan y colaboradores (2008), que mostraban la biosorción de plomo, cadmio y zinc con el hongo Penicillium simplicissimum realizando ensayos desde 20 a 40°C. Llegaron a la conclusión que la adsorción de Pb (II) era endotérmica. La energía dependiente de la eliminación de metales por los microorganismos se ve influenciada en gran medida por la temperatura, ya que el proceso de adsorción es fisicoquímico. Mientras tanto, Mishra y Roy (1996) informaron que la adsorción de Zn (II) por Penicillium sp. disminuye con el aumento de temperatura, debido a que la temperatura puede afectar la estabilidad de la pared celular de los hongos, lo que lleva a la hidrólisis de la pared celular. De acuerdo con el informe de Fan et al (2008), la adsorción de Pb (II) por Penicillium sp. era endotérmica. Realizando el respectivo control de calidad con el análisis por triplicado de muestras de material certificado de referencia NIST; SRM 1643e para Pb y Cd para aguas naturales, se evaluó la exactitud como % de error (%E) y la precisión como coeficiente de variación (CV), arrojando para Pb un CV de 0,613 y %E de 0,582, para Cd se obtuvo un CV de 0,752 y un %E de 0,238, encontrándose entre los criterios de calidad analítica (Miller y Miller 2002).

Figura 2. Efecto del pH en la Adsorción de Pb (II) y Cd (II) a 51,5 mg/L con biomasa de Penicillium sp. Figura 3. EEfecto de la temperatura (°C) en la Adsorción de Pb (II) y Cd (II) a 51.5 mg/L con biomasa de Penicillium sp.

Estudios de Isotermas de adsorción
Los resultados de isotermas Langmuir y Freundlich para hongos Penicillium sp. a 30°C se muestran en la tabla 1.

las constantes obtenidas de las isotermas Langmuir y Freundlich tuvieron coeficientes de correlación (R2) altos. Las comparaciones entre los coeficientes de correlación para isotermas Langmuir y Freundlich con biomasa de hongos Penicillium sp. se ajustan mejor al modelo de Langmuir que al modelo de Freundlich, ya que los valores R2 para Langmuir son más altos que los R2 Freundlich, además los valores de las constantes de energía de adsorción b están muy cercanos a cero, indicando esto que el modelo de isoterma para este estudio está más fuertemente soportado por isotermas Langmuir que por isoterma Freundlich, lo que sugiere que todos los centros activos de adsorción en la biomasa fúngica son equivalentes y que la capacidad de los metales para unirse a la superficie es independiente de si hay o no posiciones próximas ocupadas. Además, la adsorción se restringe a una monocapa y no existen interacciones laterales entre los iones metálicos. Los valores b indican la afinidad de un biosorbente hacia un adsorbato, a medida que sean más pequeño el biosorbente tienes más afinidad hacia el metal (Natarajan et al 2010), por ende el biosorbente que tiene más afinidad hacia el Pb (II) con valor b de 0,0030 L mg-1, seguido del Cd (II) con valor b de 0,0031 L mg-1. Los qmax que representa la máxima capacidad de biosorción del biosorbente para cada metal son muy diferentes, sobresaliendo el Pb (II) con el valor más alto (83,333 mg g-1), seguido Cd (II) con un qmax de 8,696 mg g-1, lo que sugiere que la capacidad máxima de adsorción para los tres metales recae sobre el Pb (II). Para analizar los resultados con el Freundlich, el más alto valor Kf se halló para Cd (II). Un alto de Kf Indica un volumen alto de adsorción y un alto valor 1/n (n > 1) indica una alta fuerza de adsorción. Así el más alto valor n fue hallado para Cd (II) con 0,961 seguido de Pb (II) con 0,939. Resultados similares fueron reportados por Fan y colaboradores (2008) en la remoción de Pb (II) por Penicillium Simplicissium.

Valoración de los sitios de unión metalbiomasa
La figura 4 muestra el espectro FT-IR de la biomasa del hongo Penicillium sp. antes (control) y después del tratamiento de remoción de los metales pesados. La estructura de la superficie de los hongos se infiere con los grupos funcionales encontrados en los espectros, mostrando los grupos activos del Penicillium sp. a la hora de la remoción. Se observan en la muestra control grupos en (3396), (2925), (1654), (1548) y (1150) cm-1.

Tabla 1. Modelos de isotermas Langmuir y Freundlich de la adsorción de Cd (II) y Pb (II).
Figura 4. FT-IR de Biomasa de Penicillium sp. Antes de tratamiento (control) y después de tratamiento con 51,5 mg/L de Pb (II) y Cd(II).

Un pico ancho observado entre 3200 a 3600 cm-1 fue atribuido a modos de tensión de grupos -OH y -NH. Apareció un pico fuerte en (1150) cm-1 indicando vibraciones de estiramiento C-N (Shringer et al. 1998). Enlaces C-H típico de estiramiento y vibraciones N-H fueron asignados a picos en (2925) y (1548) cm-1. El pico fuerte en (1654) indica un grupo el estiramiento del grupo C=O o amida I y amidas II (Dengy Ting 2005). La presencia de una estructura química común para polisacáridos se encontró entre 1200 a 800 cm-1 (Natarajan et al. 2010), y el pico a (1150) cm-1 es atribuido al estiramiento C-N en la muestra control, es desplazado a (1152) cm-1 en la muestra tratada después de la absorción de metales. Los cambios presentes en la región de 1660 y 1500 cm-1 para N-H también se debieron a conducir absorción (Dengy Ting 2005).

CONCLUSIONES

Un potencial biosorbente de metales pesados del tipo fúngico del genero Penicillium sp. fue aislado de suelos de mina contaminados por metales pesados. Los resultados experimentales mostraron una alta capacidad del Penicillium sp. para eliminar Pb (II) y Cd (II) en solución acuosa. La concentración inicial, el pH óptimo y condiciones de temperatura para la eliminación de Pb (II) y Cd (II) se determinó en el estudio. Los datos experimentales fueron analizados utilizando modelos de isotermas para evaluar el rendimiento del hongo biosorbente. El análisis IR muestra bandas y picos muy característicos a los enlaces de grupos funcionales -OH, -NH, C-N, C-H, N-H, C=O, amida I y amidas II y polisacáridos, la capacidad de adsorción a los metales puede ser atribuida a que la gran mayoría tienen cargas parcialmente positivas que pueden generar la atracción entre los metales y la biomasa fúngica. Por último, los resultados indican que los hongos aislados de los suelos de mina, podrían ser utilizados como un biosorbente rentable y fácilmente cultivable para la eliminación de los iones metálicos de ambientes contaminados de metales pesados.

AGRADECIMIENTOS

A la universidad de Córdoba y a Colciencias por la financiación de este proyecto contrato 223-2010.

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