INTRODUCCIÓN

El yogur es una leche fermentada de alto consumo en todo el mundo y uno de los más populares y distribuidos derivados lácteos (Sodini et al. 2005; Saint-Eve et al. 2008; Fadela et al. 2009; Hussain et al. 2009). El Codex Alimentarious define el yogur como leche coagulada que resulta de la fermentación ácido láctica de leche entera ó descremada (Adolfsson et al. 2004; Blanco et al. 2006); además de ser un producto fermentado semisólido (Hui 1993; Noni et al. 2004; Elli et al. 2006) de apariencia viscosa, textura suave y un sabor placentero, suavemente ácido (Kumar y Mishra 2004; Salvatierra et al. 2004; Ruiz y Ramírez 2009) viene mezclado con una combinación simbiótica de Streptococcus thermophilus (ST) y Lactobacillus delbruekiisub. Bulgaricus (LB) (Noni et al. 2004; Mahmood et al. 2008) o suplementado con bacterias opcionales no patógenas (Hui 1993).

El yogur contiene mayor biodisponibilidad de nutrientes que la leche (Hui 1993); es importante destacar el incremento de la digestibilidad de la proteína y de la grasa, debido a ciertas reacciones de predigestión durante la fermentación (Kumar y Mishra 2004). Comparado con la leche, es más nutritivo en términos de contenido de vitaminas, digestibilidad y como fuente de calcio y fósforo (Zahoor et al. 2003); su composición depende del tipo de leche de la cual proviene y de una gama de factores estacionales, como: leche entera o leche descremada, estación del año, periodo de lactación y modo de alimentación del bovino (Adolfsson et al. 2004; Hussain et al. 2009).

Existen estudios científicos que han caracterizado los atributos saludables de yogur, tales como: supresión de patógenos endógenos, control de síndrome de colon irritable, reducción de factores de riesgo para cáncer, control inflamatorio de enfermedades, inmunidad innata, disminución de colesterol, alivio de síntomas de alergias, mejoramiento de la tolerancia a la lactosa e inhibición de crecimiento de Helicobacter pylori (Parra 2012).

El cacao (Theobroma cacao L., Sterculiaceae) es un árbol cuyo fruto contiene 30 ó 40 semillas que tostadas, molidas y mezcladas con azúcar, vainilla y canela constituyen el chocolate (Gutiérrez 2002). Este árbol crece principalmente en África, Asia, América central y del sur (Yanus et al. 2014), su nombre científico es Theobroma cacao L. y fue Carlos Linneo quien clasificó la planta. El Theobroma cacao es un árbol de 4-8 m de alto de la familia Sterculiaceae, nativo de las regiones tropicales de América, con semillas que contienen una cantidad significativa de grasas (40-50%) y polifenoles (alrededor del 10% del peso del grano seco) (Tinoco y Ospina 2010).

El consumo de cacao inicialmente y de chocolate posteriormente, siempre se asoció con beneficios para la salud, tales como: aportar mayor fortaleza, vigor sexual, resistencia al trabajo duro y a las bajas temperaturas (Valenzuela 2007), inhibición de los procesos carcinogénicos (Gutiérrez 2002), efecto antioxidante en la prevención y desarrollo de patologías de estrés oxidativo que incluyen enfermedades cardiovasculares y cerebro vasculares. De esta forma, el consumo de antioxidantes de origen natural constituye, actualmente una recomendación a toda edad y particularmente en la edad y en la senescencia (Valenzuela 2007), además de lo anterior, el chocolate es una fuente de energía altamente nutritiva, ya que contiene aproximadamente 30% de grasa, 6% de proteínas, 61% de carbohidratos y un 3% de humedad, además contiene minerales (fósforo, calcio, hierro) y aporta vitaminas A y del complejo B (Valenzuela 2007) a lo anterior se suma un metabolismo rápido y buena digestibilidad (Nilva et al. 2006

Respecto al alto contenido de antioxidantes que contiene el chocolate, como son los flavonoides, catequinas, epicatequina, procianidinas y polifenoles, estos tienen efectos en la prevención de enfermedades infecciosas (Yanus et al. 2014; Erdem et al. 2014), control en la producción del óxido nítrico que es de vital importancia para regulación de la presión arterial y el flujo de la sangre, disminución de colesterol y en mujeres de la tercera edad mostraron que el chocolate puede mejorar la osteoporosis (Yanus et al. 2014).

Estudios in vitro e in vivo también indican que el chocolate podría ser un importante medio de reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer, por su capacidad de controlar reacciones claves implicadas en la oxidación de las LDL o de daños oxidativos al ADN (Gutiérrez 2002).

En la actualidad se buscan nuevas alternativas en la utilización de aditivos que permitan obtener mejores características fisicoquímicas, sensoriales y nutricionales en los productos lácteos. El yogur es un alimento con alto valor nutricional con una amplia difusión en su consumo a nivel mundial. Debido a esto, en los últimos años se han buscado alternativas para mejorar las características de este producto (Parra et al. 2011).

Es por lo anterior que el objetivo de este trabajo fue elaborar un yogur con chocolate y evaluar las características fisicoquímicas, sensoriales, proximales y microbiológicas durante el almacenamiento en refrigeración.

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización del experimento.

La investigación tuvo lugar en los laboratorios de Química de alimentos de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, sede Tunja.

Materiales. Las materias primas utilizadas en la elaboración de yogur fueron:
Chocolate:Se obtuvo en forma de polvo adquirido de marca nacional y posteriormente se fundió en baño maría.
Leche: Se utilizó leche liquida entera ultrapasterizada de marca reconocida.
Leche en polvo: Se utilizó leche entera de marca reconocida obtenida en el mercado local.
Cultivo iniciador: El cultivo iniciador liofilizado conteniendo los microorganismos Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus y Streptococcus thermophilus fueron adquiridos de marca Vivolac® disponible en el mercado. Sacarosa: Se adquirió en el mercado local de marca reconocida.

Preparación del cultivo iniciador. Para la preparación del cultivo se utilizó la metodología propuesta por Sori y Baba (2012), con algunas modificaciones. En la preparación del cultivo se utilizó una cabina de flujo laminar horizontal doble, sterilof modelo CFD-2000.

El cultivo iniciador para la elaboración del yogur fue preparado al pre calentar leche ultrapasterizada a 41 ºC. Una mezcla de cultivo liofilizado de marca reconocida que contenía Streptococcus thermophillus y Lactobacillus bulgaricus fue mezclado con la leche precalentada anteriormente y utilizado posteriormente para la inoculación.

Elaboración de yogur. Para la elaboración del yogur se tuvo en cuenta la metodología desarrollada por Zare et al. (2011) con algunas modificaciones como se muestra en la figura 1. Se manejaron dos tratamientos para la elaboración de yogur, un control que contenía 10% de sacarosa y un segundo tratamiento que contenía 6% de chocolate basándose la concentración utilizada en ensayos previos a este estudio.

Es importante notar que la incubación de yogur para ambos tratamientos se detuvo hasta que las muestras alcanzaron un pH en un intervalo entre 4 y 4,5; valores recomendados por Olson y Aryana (2008) y Briceño et al. (2001) en sus investigaciones relacionadas con yogur. Las muestras se almacenaron en condiciones de refrigeración a 4 ºC en recipientes de plástico con tapa hermética del mismo material durante un periodo de 30 días; los días 1, 3, 9, 21 y 30 de almacenamiento se evaluó pH, acidez titulable y sinéresis.

Figura 1. Elaboración de yogur (Zare et al. 2011)

Además se realizó análisis sensorial, análisis proximal y recuento de bacterias ácido lácticas.

Métodos
Caracterización fisicoquímica.
Sinéresis: Para esta determinación se utilizó una centrífuga modelo Rotina 46. Se pesaron 20 mL de cada una de las muestras de yogur y se sometieron a centrifugación por un tiempo de 20 minutos a una velocidad de 4000 rpm. Luego de la centrifugación se obtuvieron los mililitros del sobrenadante (lactosuero) y se calculó el grado de sinéresis mediante la relación entre el volumen del sobrenadante y el volumen de la muestra (Charoenrein et al. 2008). El porcentaje de sinéresis fue determinado en los días 1, 3, 9, 21 y 30 bajo condiciones de refrigeración.
Acidez titulable: La acidez titulable fue medida por titulación de 10 mL de muestra con 0,1 N de NaOH y utilizando fenolftaleína como indicador. El resultado se expresó como porcentaje de ácido láctico (962.12/90 de la AOAC). Esta determinación se realizó los días 1, 3, 9, 21 y 30 en condiciones de refrigeración 4 ºC
pH: El pH del yogur fue medido con un pH metro digital SCHOTT CG-842 durante los días 1, 3, 9, 21 y 30 en condiciones de refrigeración 4 ºC. El electrodo fue calibrado con soluciones buffer 7 y 4. (945.27/90 de la AOAC).

Conteo de células viables ácido lácticas en yogur.
Preparación de la muestra. Las muestras de yogur (1 mL) fueron individualmente mezcladas con 9 mL de agua peptonada. La mezcla fue agitada y se preparó diluciones 10‑1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5.
Enumeración de bacterias acido lácticas utilizando el método vertido en placa. Las bacterias ácido lácticas fueron enumeradas según método descrito por Kailasapathy et al. (2008) con algunas modificaciones. El agar utilizado fue Man, Rogosa y Sharpe ( MRS Scharlau®) la solución fue esterilizada en autoclave seguido por enfriamiento a 45 ºC. una vez fundido (15 mL) fue colocado en cajas de Petri. El yogur diluido apropiadamente (1 mL) fue transferido en agar MRS fundido. Se mezcló suave y uniformemente la mezcla. Las caja de Petri fueron selladas con parafina y se dejaron a temperatura ambiente para permitir que el agar se solidificara. Posteriormente, las placas se invirtieron y se colocaron en incubadora a 37 ºC por 48 horas.

Caracterización proximal.
Se seleccionó una muestra de yogur control y una muestra de yogur con chocolate para realizar los siguientes análisis cada uno por duplicado:
Determinación de humedad: Se llevó a cabo por el método gravimétrico 930.15/90 de la AOAC (1990).
Determinación de cenizas: Se realizó siguiendo el método 942.05/90 de la AOAC (1990), secando previamente las muestras a 110 ºC y posteriormente calcinadas a una temperatura de 550 ºC, hasta peso constante.
Proteína: Se efectúo mediante el método de Kjeldalh de acuerdo a la técnica 955.04/90 (AOAC 1990), el cual determinó la concentración de nitrógeno presente en la muestra para luego ser transformado a través de un factor en proteína de 6,38.
Fibra cruda: Se tomaron muestras previamente desengrasadas y se les realizó digestión ácida en presencia de H2SO4 0,255 N y digestión alcalina en presencia de NaOH 0,313 N. Para la determinación del porcentaje de fibra cruda, fue utilizado el método Weende 962.09/90 de la AOAC (1990).
Determinación de extracto etéreo. El ensayo se realizó utilizando el método 920.39/90 de la AOAC de 1990.
Carbohidratos: Se determinó por diferencia.

Evaluación sensorial
Para evaluar si la adición de chocolate incidía en los diferentes atributos sensoriales del yogur, como son el color, olor, sabor, viscosidad y calificación global. Se seleccionó muestra de yogur control y yogur con chocolate. Para ello se seleccionó un grupo de 30 personas no entrenadas, empleándose una prueba descriptiva por calificación de escalas de intervalo según la norma NTC 2680 del 07 de marzo de 1990. La escala de intervalo empleada para la evaluación sensorial de las muestras de yogur fue 1: me disgusta muchísimo; 2: me disgusta moderadamente; 3: no me gusta ni me disgusta; 4: me gusta moderadamente; 5: me gusta muchísimo.

Diseño experimental.
Se utilizó un diseño experimental al azar de un solo factor, donde la respuesta a medir fue el pH, acidez, sinéresis, evaluación sensorial, proximal y recuento de bacterias ácido lácticas. Los resultados son presentados con la desviación estándar de las determinaciones por duplicado. El tratamiento de los resultados se realizó mediante análisis de varianza ANOVA en el paquete estadístico Excel Windows vista (Microsoft Office).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Comportamiento de acidez y pH.
Acidez
En la figura 2 se observa el comportamiento de la acidez de yogur control y yogur con chocolate durante el almacenamiento en refrigeración. La acidez en ácido láctico del yogur control tuvo promedio durante el almacenamiento 0,77% mientras que el yogur con chocolate la acidez fue en promedio 0,88%. Se observa además, que la acidificación para la muestra de yogur con chocolate fue mayor en comparación con las muestra control, lo que indica que la producción de acido láctico fue mayor por parte de las BAL en presencia de chocolate; en la muestra de yogur con chocolate a partir del día 3 de almacenamiento la acidez permaneció casi constante con valores en porcentaje de 0,91 ± 0,08 de ácido láctico.

Figura 2. Comportamiento de pH y acidez durante el almacenamiento de yogurt control y yogurt con chocolate Parra - Características de yogur con chocolate

Los cambios anteriores pueden atribuirse a una hidrólisis de los componentes del chocolate, como también, a los posibles cambios bioquímicos presentes en el yogur durante el almacenamiento. Al respecto Briceño et al. (2001), indican que durante el almacenamiento de un yogur sin la adición de chocolate, la acidez aumentó en condiciones de refrigeración máximo hasta 1,5% expresada en acido láctico. Igualmente, Hussain et al. (2009) encontraron en un yogur natural al final del experimento en el día 10 de almacenamiento una acidez como máximo de 1,44% en ácido láctico.

Probablemente el chocolate estimuló el metabolismo de las BAL para la producción de ácido láctico a través de la ruta de la glucólisis durante la incubación y posterior almacenamiento de yogur, lo anterior explicaría la diferencia de comportamiento entre el yogur control y el yogur con chocolate durante el almacenamiento.

pH En la figura 2 se observa el comportamiento del pH. El promedio para la muestra que contenía chocolate fue 4,43 y para las muestras de yogur control fue 4,39 durante el almacenamiento; además se observa que al final del experimento, el pH final fue igual para los dos tratamientos. En los dos tratamientos se presentó una disminución de pH, lo anterior pudo atribuirse a que durante el almacenamiento en condiciones de refrigeración, ocurrió una actividad microbiana por parte de las bacterias ácido lácticas presentes en el yogur tal y como lo señala Lubbers et al. (2004) en yogur almacenados durante más de 20 días bajo refrigeración.

Al respecto, en otros estudios realizados por Sahan et al. (2008); Ruiz y Ramírez (2009) y Olson y Aryana (2008) utilizando Lactobacillus acidophilus en la elaboración de yogur y leche descremada reportaron que el pH de yogur disminuía durante el almacenamiento en condiciones de refrigeración entre 3,8 y 4,5. Al respecto, Hassan y Amjad (2010) mencionan que la reducción de pH en el yogur puede ser por la degradación de la lactosa en ácido láctico, esta disminución de pH durante el almacenamiento se ve reflejada en la acidificación.

De acuerdo a otras investigaciones realizadas por Kailasapathy et al. (2008), los cambios bajos de pH son debido además a cambios en el contenido de ácido en el yogur, en este caso ácido láctico.

En la tabla 1 se observa que no existe evidencia estadística para afirmar que los parámetros fisicoquímicos influyan en el almacenamiento del yogur.

Tabla 1. Análisis de varianza para análisis físico químico
Figura 3. Comportamiento de la sinéresis durante el almacenamiento de yogurt control y yogurt con chocolate

Comportamiento de sinéresis
En la figura 3 se describe el comportamiento de la sinéresis para los dos tratamientos; es notable que el yogur con chocolate tuvo un efecto en la reducción de la sinéresis durante el almacenamiento; la diferencia de la sinéresis en las dos muestras es muy amplia al final del almacenamiento, 13% y 49% para el yogur con chocolate y yogur control respectivamente. Al respecto Díaz et al. (2004) reportó valores para sinéresis entre 45-65% para un yogur control (sin fibra, elaborado con leche entera y sacarosa); este valor coincide con el obtenido en este estudio de 51% al final del almacenamiento para el caso de yogur control.

El grado de sinéresis para el yogur control aumentó durante el almacenamiento debido a la pérdida de estabilidad y retención de agua de los componentes de yogur (Díaz et al. 2004).

Este comportamiento puede ser explicado también por la disminución en el pH durante el almacenamiento, lo cual puede tener efecto de contracción en la matriz de la micela de caseína causando más eliminación de lactosuero (Achanta et al. 2007).

Peng et al. (2009) mencionan que el contenido de sólidos en un yogur ayudan a prevenir la separación de lactosuero, igualmente mencionan que un aumento en el contenido de proteína podría resultar en una textura fuerte con menos separación de lactosuero.

Análisis proximal
En la tabla 2 se observa que el yogur elaborado con chocolate tuvo mayor contenido de proteína, fibra y grasa, lo anterior demuestra el valor nutricional del yogur con chocolate en comparación con el yogur control; sin embargo, el análisis estadístico indicó que no existen evidencias de que las variables proximales influyan en el almacenamiento del yogur para los dos tratamientos.

Análisis sensorial
En la tabla 3 se observa que el yogur elaborado con chocolate tuvo buena aceptación entre los panelistas en comparación con el yogur control, lo anterior indica que la adición de chocolate antes de la incubación y posterior almacenamiento de yogur proporcionó características adecuadas al producto final. Sobresale que los parámetros evaluados en el yogur con chocolate tuvieron calificaciones similares al yogur control. Lo anterior es corroborado por el análisis estadístico de la tabla 4 de la cual se analiza que no existe evidencia estadística para afirmar que la evaluación sensorial de las muestras que contenían yogur con chocolate y sin chocolate son diferentes.

Análisis microbiológico
En la tabla 5 se observa que hubo un incremento de 5,3x105 ± 0,05 a 9,4x105 ± 0,19 UFC/mL en el número de bacterias ácido lácticas durante el almacenamiento en el yogur que contenía chocolate, lo anterior es debido probablemente a que el chocolate en su composición contenía proteína y sacarosa estimulando aun más el metabolismo microbiano de BAL presentes en el yogur a través de la ruta metabólica de la glucólisis.

Tabla 2.Análisis proximal de yogurt control y yogur con chocolate
Tabla 3. Evaluación sensorial de yogur con chocolate y yogur control
Tabla 4. Análisis de varianza para el análisis sensorial
Tabla 5. Recuento de bacterias ácido lácticas

El valor final de recuento para bacterias ácido lácticas para el yogur con chocolate es similar al presentado por Shori y Baba (2012), reportando para un yogur comercial elaborado con leche de vaca un valor de 1,4x106 UFC/mL al día 21 del almacenamiento. Este valor es cercano al mostrado en la tabla 2 en el yogur con chocolate 4,88x105 UFC/mL.

CONCLUSIONES

Este estudio mostró que la adición de 6% de chocolate al yogur tuvo comportamiento similar en comparación con el tratamiento al que se adicionó 10% de sacarosa durante el tiempo de almacenamiento. Lo anterior se evidenció en resultados de pH y acidez típicos para un yogur comercial con características propias. Los valores de sinéresis disminuyeron durante el almacenamiento favoreciendo así características sensoriales las cuales fueron sobresalientes resaltándose el sabor, color y textura. El análisis proximal indicó un aumento de valores de proteína, fibra y grasa respecto al yogur con sacarosa. Los valores de conteo de bacterias ácido lácticas en el yogur que contenía chocolate indicaron un aumento respecto al yogur con sacarosa, lo anterior indica que esta sustancia estimuló el metabolismo de las bacterias acido lácticas durante el almacenamiento de yogur. Basándose en las características fisicoquímicas, sensoriales, proximales y microbiológicas se sugiere que la adición de chocolate puede ser considerado potencialmente un ingrediente para elaboración de yogur.

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus agradecimientos a la Dirección de Investigaciones-DIN de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por su apoyo para la divulgación de estos resultados.

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