[2] Biólogo.   Coordinador   Laboratorio   de   Calidad   de   Agua,   Universidad   del   Magdalena,   Santa   Marta,   Magdalena.  Colombia.  Carrera  32  #  22  –  08  San  Pedro  Alejandrino.  PBX  (57)  (5)  4217940  Ext.  3272   

[3] Bióloga.  Programa  de  Biología,  Universidad  del  Magdalena,  Santa  Marta,  Magdalena.  Colombia.  Carrera  32  #  22  –  08  San  Pedro  Alejandrino.  PBX  (57)  (5)  4217940  Ext.  3242   

                 

INTRODUCCIÓN

Una   de   los   insectos-­plaga   de   mayor   impacto   económico   en   Colombia   es   el   gusano  cogollero  del  maíz,  Spodoptera  frugiperda  (Lepidoptera:  Noctuidae).  Teniendo  en  cuenta  que  estas  larvas  logran  alimentarse  de  28  especies  vegetales  cultivadas,  entre  las  cuales  se  destacan  el  maíz,  sorgo,  algodón,  soya,  higuerilla,  tomate  de  huerta,  caña  de  azúcar,  ajonjolí,   arroz,   maní,   melón   y   girasol.   Elige   para   su   alimentación   a   las   gramíneas,  cultivadas   o   no,   causando   mermas   elevadas   a   los   cultivos,   ante   todo,   cuando   sus  poblaciones  logran  altos  niveles  durante  las  épocas  de  verano  (Fernández  2002). 
 

Al  presente  una  de  las  formas  más  frecuentes  de  controlar  plagas  en  los  disímiles  cultivos  se   realiza   mediante   el   uso   de   agroquímicos;;   practica   que   ha   permitido   conservar  poblaciones   de   plagas   en   niveles   permisibles   y   disminuir   el   daño   que   reducen   el  rendimiento   del   cultivo.   No   obstante   el   uso   indistinto   ha   generado   problemas   de  contaminación  del  suelo  y  fuentes  hídricas.  Asimismo,  se  eliminan  los  enemigos  naturales  de  insectos  y  hongos  secundarios  que  ante  la  desaparición  de  sus  reguladores  naturales  pueden  convertirse  en  plagas  de  valor  económico  (Quintero  2015).

En  nuestro  país,  no  existen  estadísticas  concernientes  a  pérdidas  confiables  ocasionadas  por  el  insecto,  pero  en  el  cultivo  de  maíz  tecnificado,  se  discurre  que  un  5,6%  a  un  10%  de  los  costos  de  producción  pertenecen  al  control  químico  de  la  plaga  (URPA,  citado  por  Polania  et  al.  2009). 

“Una   de   las   alternativas   frente   al   control   de   Spodoptera   frugiperda   es   el   uso   de  insecticidas   biológicos   como   la   bacteria   Bacillus   thuringiensis   y   los   virus  entomopatógenos  como  los  Baculovirus”  (Quintero  2015).  Los  baculovirus  se  han  tratado  de  manera  extensiva  para  el  control  biológico  de  disímiles  plagas  del  orden  lepidóptera  a  nivel  cosmopolita  (Szewczyk  et  al.  2011),  con  excelentes  resultados. 

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Esta   investigación   se   realizó   en   las   instalaciones   del   insectario   del   Instituto   de Biotecnología,   y   en   el   laboratorio   de   control   biológico   de   la   Facultad   de   Ingeniería  Agronómica   de   la   Universidad   Nacional   de   Colombia   sede   Bogotá.   La   temperatura  promedio   interna   del   laboratorio   fue   de   27±5   °C,   humedad   relativa   de   75±5%   y   un  fotoperiodo   de   12:12   Horas   (Luz-­Oscuridad).   La   cepa   y   los   aislamientos   de   Bacillus  thuringiensis   fueron   cultivados   y   fermentados   en   el   Instituto   de   Biotecnología   de   la  Universidad  Nacional  de  Colombia  (Tabla  1). 

Para  la  investigación  se  consideraron  una  cepa  comercial  (HD1),  10  aislamientos  nativos  de  un  organismo  patógeno  y  uno  de  su  hospedero,  las  cuales  presentan  las  siguientes  características: 
 
Se  recolecto  una  raza  de  S.  frugiperda  en  un  cultivo  de  sorgo  de  la  zona  del  Espinal (Tolima).  Para  ello  se  procedió  a  la  recolección  de  larvas  de  todos  los  instares,  en  campo.  Se  realizó  la  cría  masiva  de  S.  frugiperda,  posteriormente  las  larvas  de  primer  instar  fueron   llevadas   a   copas   plásticas   con   1,35   ml   de   dieta   y   su   respectiva   dosis   de   B.  thuringiensis.  Estas  fueron  seleccionadas  por  el  Instituto  de  Biotecnología  de  acuerdo  a  la  concentración  de  proteína  que  produzcan  y  su  posible  espectro  de  acción  comparada  con  la  cepa  comercial  HD1.   
 
Determinación  de  la  actividad  insecticida  de  los  10  aislamientos  nativos  de  Bacillus  thuringiensis  con  relación  al  estándar  hd1.  Después  de  obtener  la  CL50    de  la  cepa  comercial  HD1,  se  utilizó  esta  concentración  expresada  en  i.a.  para  cada  uno  de  los  10  aislamientos  nativos  de  B.thuringiensis.  Para  cada  aislamiento  a  probar  se  suspendió  en  el  agua  que  se  agrega  a  la  licuadora  en  el  momento  de  preparar  la  dieta,  luego  de  licuada  la  dieta  se  vertió  2  ml  por  vaso  plástico;;  posteriormente  cuando  se  gelificó  se  colocó  una  larva  de  primer  instar  por  copa  utilizando  un  pincel;;  por  cada  aislamiento  se  utilizó  una  dosis  con  tres  unidades  experimentales,  cada  una  de  ellas  con  20  larvas  colocadas  individualmente  para  un  total  de  60  larvas  por  aislamiento  incluyendo  al  testigo  absoluto.  En  total  se  utilizaron  780  larvas  de  primer  instar  para  el  segundo  ensayo. 
 

Prueba  de  efectividad.  Estas  se  realizaron  con  el  fin  de  determinar  si  la  muerte  del  insecto  fue  causada  por  la  bacteria  o  por  un  factor  externo  a  esta  como  manipulación,  inapetencia  u  otros  organismos.  Para  esta  se  colectaron  larvas  muertas  en  las  diferentes  dosis   y   aislamientos,   se   les   agregó   agua   y   con   la   ayuda   de   un   vortex   se   hizo   una  suspensión  homogénea  de  la  cual  se  sacó  parte  para  realizar  un  cultivo  en  agar  nutritivo  y  comprobar  que  efectivamente  la  bacteria  fue  ingerida  por  el  insecto;;  de  la  otra  parte  se  tomó   una   gota   para   montarla   en   una   lámina   porta-­objeto   y   hacer   observaciones   al  microscopio,  para  distinguir  fauna. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La  caracterización  de  cada  aislamiento  nativo  se  puede  observar  en  la  tabla  2.   
De  Producción:  Para  la  fermentación  de  las  cepas  de  B.  thuringiensis  se  utilizó  caldo  nutritivo   (HCO);;   este   proceso   se   llevó   a   cabo   a   29   °C   y   200   rpm.   Después   de   la  fermentación  se  determinó  la  cantidad  de  ingrediente  activo  por  la  técnica  de  LOWRY,  centrifugando  a  4000  rpm  por  15  minutos  a  4  °C  en  un  equipo  Survall  RC-­3B  (Tabla  2). 

Determinación de rangos de mortalidad para el testigo comercial hd1. Con el fin de establecer parámetros de evaluación y comparación con aislamientos a ensayar, como cantidad de dosis a usar, metodología para realizar la lectura de mortandad y otros, se procedió a determinar los parámetros con la cepa comercial en dieta purificada (Tabla 3).

Considerando  el  resultado  anterior,  se  procedió  al  análisis  de  regresión  “Método  Probit”  para   el   instar   estudiado,   utilizando   los   datos   de   mortalidad   originales.   La   salida   del  análisis  de  regresión  “Método  Probit”,  mediante  el  paquete  estadístico  SAS,  en  los  cuales  se  indica  el  intercepto  y  su  pendiente,  dando  como  ecuación  la  siguiente: 
 
Y=  7,032  +  0,629   
 
Cálculo  matemático  de  la  concentración  letal  media.  Con  base  en  la  ecuación  de  regresión   “Probit”   hacemos   Y=5   (valor   Probit   correspondiente   al   50%   de   la   variable  dependiente  mortalidad)  y  obtenemos  el  valor  de  X  (variable  independiente),  a  este  valor  se  le  halla  el  antilogaritmo  y  obtenemos  el  valor  real  de  la  CL50  expresada  en  miligramos  de  ingrediente  activo  por  mililitro  de  dieta  purificada. 
Y=  7,032  +  0,629X 
Y=5 
X=  5-­7,032  /  0,629 
X=  -­3,230 
Ahora  Antilogaritmo  de  -­3,230 
Obtenemos:  CL50  =  5,88  x  10ˉ⁴  (mg  ml-­1  de  dieta) 
 

El  análisis  de  la  concentración  letal  media,  el  límite  de  confianza  y  pendientes  de  la  línea  de  regresión  para  condiciones  de  laboratorio  no  mostró  diferencias  significativas  entre  las  replicaciones  del  bioensayo,  por  presentarse  en  todos  los  casos  sobrexposición  de  los  límites  de  confianza  del  95%  (Tabashnik  1990)  Mortalidad  en  la  Determinación  de  la  CL50  de  B.  thuringiensis.  En  primer  instar  larval   de   S.   frugiperda.   En   la   ecuación   de   regresión   obtenida   para   el   tiempo   de  evaluación   de   120   horas,   se   sustituyó   los   valores   de   X   por   el   logaritmo   de   las  concentraciones  que  se  usaron  en  el  experimento  (Tabla  4). 4

 

Diseño  experimental.  Para  el  primer  ensayo  de  la determinación  de  CL50    se  utilizó  un  diseño  completamente  al  azar,  con  7  tratamientos  (cada  uno  con  25  larvas  de  primer  instar)  y  3  replicaciones.  Para  el  segundo  ensayo  de  la  determinación  de  aislamientos  promisorios  de  Bt,  se  arregló  un  diseño  completamente  al  azar,  con  11  tratamientos  (cada  uno  con  20  larvas  de  primer  instar)  y  3  replicaciones.   

Con  el  dato  de  mortalidad  obtenido  a  las  120  horas,  en  condiciones  de  laboratorio  y  previamente  hecha  la  transformación  de  éstas  mediante  la  fórmula  y=  arcoseno    √X.    Los  resultados  del  ensayo,  fueron  sometidos  a  un  análisis  de  varianza  con  el  procedimiento  análisis   de   varianza   del   software   estadístico   SPSS   versión   23.   Con   un   nivel   de  significación  del  5%,  obteniéndose  el  siguiente  resultado:  Ho=  µi  =  µ  para  todo  i  H1=  µi  ≠  µ  para  al  menos  algún  i.  La  significancia  de  los  tratamientos  es  0,001  menor  al  valor  de  alfa  de  0,05,  por  tanto  se  rechaza  la  hipótesis  nula  (Ho)  de  igualdad  entre  tratamientos,  y  del   cual   se   puede   concluir   que   los   tratamientos   discriminados   en   dosis   presentan  diferencias  altamente  significativas  entre  sí.  El  coeficiente  de  variación  obtenido  fue  de  14,81%  lo  cual  concuerda  con  lo  reportado  por  Dulmage  et  al.  Citado  por  (Gallegos  1990),  donde   menciona   que   para   validar   un   bioensayo   el   coeficiente   de   variación   debe   ser  menos  o  igual  al  20%. 

Con  la  concentración  letal  media  para  larvas  de  primer  instar  de  S.frugiperda  con  la  cepa  HD1  de  B.thuringiensis  la  cual  fue  de  3,25  µg  cm²,  que  comparado  con  los  resultados  obtenidos  por  (Del  Rincón  et  al.  2006),  para  tres  cepas  nativas  de  B.thuringiensis  se  estimaron  valores  de  CL50  de  7,64,  3,87  y  3,97  µg  cm²,  respectivamente,  Se  presentó  un  nivel  menor  de  CL50.  Esto  se  puede  evidenciar  por  lo  corroborado  por    (López-­Edwards  et  al. 1999)   quienes   encontraron,   que   las   larvas   de   S.frugiperda   tienen   diferente   grado   de  susceptibilidad  a  B.  thuringiensis,  relacionado  con  la  ubicación  geográfica  del  insecto. 

Además   (Hernández   1988),   menciona   que   las   larvas   de   S.frugiperda,   presentan  susceptibilidad  diferente  a  B.thuringiensis,  relacionado  a  la  especie  o  subespecie  que  se  utilice  en  el  control  biológico.  Es  transcendental  resaltar  que  la  susceptibilidad  de  una  especie  de  lepidóptero  a  las  toxinas  de  B.  thuringiensis,  obedece  directamente  al  tipo  de  toxinas  que  contenga  cada  cepa,  ya  que  se  conoce  que  existe  una  enorme  variedad  de  proteínas  Cry,  con  más  de  250  diferentes  genes  que  las  codifican  (Crickmore  et  al.  1998),  citado  por  (Del  Rincón  et  al.  2006). 
Es   importante   destacar   que   la   cepa   nativa   (M3008),   fue   la   más   tóxica   de   las   diez  estudiadas,   de   modo   que   sería   importante   continuar   con   una   identificación   a   nivel  molecular  de  su  contenido  de  genes  Cry,  como  ya  se  ha  realizado  con  anterioridad  para  disímiles  cepas  de  B.  thuringiensis  por  medio  de  la  técnica  del  PCR  (Chak  et  al.  1994  y  Bravo  et  al.  1998).  Las  larvas  de  primer  instar  de  S.  frugiperda,  se  ven  afectadas  con  el  uso   de   toxinas   de   B.thuringiensis   afectando   su   desarrollo   larval   y   el   fenómeno   de  alimentación,   producto   de   la   intoxicación   bacteriana,   tal   como   lo   registran   (Navon      y  Federici  1993;;  Stapel  et  al.  1998  y  Flórez  2000).

CONCLUSIÓN

Se  determinó  la  concentración  letal  media  para  larvas  de  primer  instar  de  S.  frugiperda  con  la  cepa  HD1  de  B.thuringiensis  la  cual  fue  de  5,88  X  10ˉ⁴  mg/ml  de  dieta. 

El   desarrollo   de   la   metodología   planteada   es   viable   de   realizar   para   insectos   que   se  pueden   criar   en   condiciones   de   laboratorio;;   esta   permite   comparar   directamente   la  efectividad  de  cepas  o  aislamientos  nativos  de  B.thuringiensis  a  las  que  no  se  les  conoce  su  actividad,  con  cepas  con  las  que  ya  se  les  ha  determinado  su  actividad  en  insectos  lepidópteros.  El  aislamiento  nativo  de  mejor  comportamiento  en  dieta  purificada  en  larvas  de  primer  instar  de  S.  frugiperda  es  la  M3008,  seguidamente  del  aislamiento  M4001. 

En  lo  concerniente  al  tiempo  de  evaluación  del  Bioensayo,  se  concluye  que  el  tiempo  óptimo  de  evaluación  de  los  tratamientos  es  a  las  120  horas  porque  en  ese  tiempo  el  porcentaje  de  mortalidad  larval  se  estabiliza. 

REFERENCIAS

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López-­Edwards,  M.,  Hernández-­Mendoza,  A.,  Pescador-­Rubio,  J.,  MolinaOchoa,  R.,  Lezama-­Gutiérrez,  J,  Hamm,  J.  and  Wiseman,  B.  1999.  Biological  diferences  between  five  populations  of  fall  armyworm  (Lepidoptera:Noctuidae)  collected  from  corn  México.  Fla.  Entomol.  82(2):  254-­262.  
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